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PCR反應樣品RNA的抽提
日期：2022-11-15 22:22
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摘要：PCR反應技術樣品RNA的抽提
實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
樣品RNA的抽提：
1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。