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熒光定量PCR對標準品要求
日期：2022-11-15 16:36
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摘要：熒光定量PCR對標準品要求
熒光定量PCR檢測的是起點熒光值，定量分析的是未經PCR放大之前的起始模板量。
這就涉及到熒光定量PCR的第2個關鍵點——定量方式的選擇：相對定量和絕dui定量。
絕dui定量可測定目的基因在樣本中的具體拷貝數，相對定量測定的是目的基因在兩個或多個樣本中的相對表達水平，定量方式的選擇取決于實驗目的。
絕dui定量必須使用已知濃度/拷貝數的標準品制作標準曲線，絕dui定量對標準曲線的準確度要求較高，相對來說對標準品的要求也比較高。標準品的要求：
（1）標準品與待測樣本用相同的引物進行擴增，確保引物在兩者中擴增效率相同。
（2）標準品來源可以是基因組DNA，質粒DNA，純化的PCR產物，Total RNA（cDNA），體外轉錄的 RNA等，其中基因組DNA和Total RNA（cDNA）不能直接用作標準品。
（3）標準品必須經過準確定量，其拷貝數必須已知。
（4）標準品與待測樣本要在同一次實驗以及相同的條件下完成，擴增效率盡量接近。
標準曲線的制作:
將標準品稀釋5~6個濃度梯度，稀釋倍數可以選擇5倍（cDNA）或10倍（質粒DNA、體外轉錄RNA）。